技術知�
紫外交聯儀實驗步驟參�
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預�,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL�80ul,50mL中加�300ul)
(2)取約0.8g菌絲�(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養就更好說�),在液氮中迅速磨成精細粉�,裝入50mL離心�,�1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取�,顛倒混�
(3)65℃水�3-10 min,期間混勻2-3�
(4)加入等體積的�(注意是酸酚pH4.5):氯仿:異戊�(25:24:1)抽提(10,000rpm,4�,5 min)
(5)取上�,等體積的氯仿:異戊�(24:1)抽提(10,000rpm,4�,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放�6h以上(或過�)
(7)10,000rpm,4℃離�20min
(8)棄上�,�500ul SSTE溶解沉淀
(9)�:氯仿:異戊�(25:24:1)抽提兩次,氯仿:異戊�(24:1)抽提1�(10,000rpm,4�,5min)
(10)�2V體積的無水乙�,�-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離�20 min
(12)棄上�.沉淀�70%酒精漂洗一�,干燥
(13)�200ul的DEPC處理水溶�
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質�
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較�,可以增加抽提次數)
紫外交聯儀技術優�
1. 能有效的處理土壤樣品中一些很難處理的組分�: 真細菌孢�(eubacterial spores)、內芽孢(endospores)、格蘭仕陽性菌(gram positive bacteria)、酵�(yeast)、線�(nematodes)、海�(algea)、真�(fungi)等�
2. 樣品處理過程中使用的 MT Buffer和Sodium Phosphate Buffer可在整個提取過程中有效的保護核�,并wu限度的降低RNA污染�
3. 基于硅珠的純化方�,可有效地去除腐植酸、多元酚等PCR抑制�
4. 純化所得的DNA可直接用于PCR、酶切等后續實驗之中�
5. 對腐植酸含量特別高的樣品,附加額外的處理方法�
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