技�(shù)知識(shí)
恒溫珠浴器在�(xì)胞的�(fù)蘇實(shí)�(yàn)的應(yīng)用_簡單步驟
一.�(shí)�(yàn)名稱:�(xì)胞的�(fù)�
�.�(shí)�(yàn)?zāi)�?將凍存的�(xì)胞恢�(fù)活�
�.�(shí)�(yàn)原理:在低�-70�的超低溫條件�,有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)其緩�,甚至終止。所謂冷凍保�,就是將體外培�(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保�(hù)劑的溶液�,以一定的冷凍速率降至零下某度(一般是低于-70°c的超低溫條件),并在此溫度下�(duì)其長期保存的過程。而復(fù)蘇就是將凍存�-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37�,使細(xì)胞存�(shí)的冰晶迅速融�,避免冰晶緩慢融化�(shí)�(jìn)入細(xì)胞形成再�(jié)�,�(duì)�(xì)造成損害�
�.�(shí)�(yàn)步驟
1.�(shí)�(yàn)前準(zhǔn)�
1).將珠浴器�DHB-200��(yù)熱至37�,將培�(yǎng)液預(yù)熱后分裝到培�(yǎng)皿中
2�.離心管、吸管、培�(yǎng)瓶等�
2.取出凍存�
1�.根據(jù)�(xì)胞凍存記錄按�(biāo)簽找到所需�(xì)胞的編號(hào).
2�.從液氫罐中取出細(xì)胞盒,取出所需的細(xì)�,同時(shí)核對(duì)管外的編�(hào)
3.迅速解�
1�.迅速將凍存管投入到已經(jīng)�(yù)熱的水浴鍋中迅速解�,并要不斷的搖�(dòng)的液體迅速融�
2�.�1-2min后凍存管�(nèi)液體完全溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外�,再拿入超凈臺(tái)�(nèi)�
4.平衡離心:用架盤天平平衡后,放入離心�(jī)�3000r/min離心3min
�.制備�(xì)胞懸�
1�.吸棄上清�
2�.向離心管�(nèi)加入10m培養(yǎng)�,吹打制成�(xì)胞懸�
�.�(xì)胞計(jì)�(shù):�(xì)胞濃度以5x105/ml為宜�
�.培養(yǎng)�(xì)�
將復(fù)合細(xì)胞計(jì)�(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶養(yǎng)瓶放�37�5%CO2的培�(yǎng)箱內(nèi)24小時(shí)(或�24-48小時(shí))后換液繼�(xù)培養(yǎng)培養(yǎng),換液的時(shí)間由�(xì)胞情況而定�
初學(xué)者易犯錯(cuò)誤:
1.珠浴器(DHB-200)未�(yù)熱或者未�(yù)熱到37�
2.珠浴��DHB-200��(nèi)凍存管太�,�(dǎo)致傳熱不�,使融化時(shí)間延�
3.離心前忘記平�,�(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失�
4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多,忘記更換吸頭和吸�,�(dǎo)致細(xì)胞交叉污染�
版本2
一.�(xì)胞復(fù)蘇的原則
在實(shí)際操作中,凍存�(xì)胞要�(jìn)行復(fù)�,再培�(yǎng)傳代。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法。以保證�(xì)胞外�(jié)晶快速融�,以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi),再次形成胞內(nèi)�(jié)晶損傷細(xì)�
�.�(xì)胞復(fù)蘇的主要操作步驟
(1)佩戴眼鏡和手�,從液氮罐中取出安瓿或冷凍�
(2)迅速放�38℃恒�珠浴器(DHB-200��,并不�(shí)搖動(dòng),�1分鐘�(nèi)使其完全融化,然后在無菌下取出�(xì)�
(3)�1000r/min速度下離�5~10分鐘,棄去上層�,加入適量培養(yǎng)液后接種于培�(yǎng)瓶中,接種濃度1×10°幾L,�37℃溫箱靜置培�(yǎng),次日更換一次培�(yǎng)�,繼續(xù)培養(yǎng),觀察生長情況。若�(xì)胞密度較�,及時(shí)傳代。或無需離心直接將細(xì)胞加入瓶�,并加入培�(yǎng)基貼壁培�(yǎng)12~24小時(shí)�,充去上清,換入新鮮培養(yǎng)基繼�(xù)培養(yǎng)�
�.注意事項(xiàng)
在細(xì)胞復(fù)蘇操作時(shí),�(yīng)注意融化凍存�(xì)胞速度要快,可不�(shí)搖動(dòng)安瓿或冷�,使之盡快通過最易受損的溫度�(-5~0�)。這樣�(fù)蘇的凍存�(xì)胞存活率�,生長及形�(tài)良好。然�,由于凍存的細(xì)胞還受其他因素的影響,有時(shí)也會(huì)有部分細(xì)胞死亡。此�(shí),可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上(已死�)的細(xì)胞輕輕倒掉,再補(bǔ)以適量的新培�(yǎng)�,也會(huì)獲得較為滿意的結(jié)果�