技術知�
蛋白質組學研究,樣本準備知多少?
俗話說好的開始是成功的一半,要想實驗成功,除了要有好的idea,樣本采集和預處理也至關重要。那么蛋白質組學研究中應該如何處理樣本呢?今天咱們就來聊聊蛋白質組學研究中那些常見樣本的準備�
動物�
取新鮮組織,剔除血管、脂肪、結締組織等與研究無關的干擾組織�
用生理鹽水或PBS清洗血漬和污染物,用無塵吸水紙吸去表面液體�
將組織剪切成邊長 0.5 cm 小塊� 100 mg 左右小塊�
將組織塊用液氮速凍5 min以上,并�-80℃保存�
腦、心、肝、脾、肺、腎、肌肉、皮膚等常規動物組織,定量蛋白質組推薦送樣量>200 mg;修飾蛋白質組推薦送樣量>500 mg�
植物�
地上部分在樣本離體前用無菌水清洗雜質,水干后采集樣本;地下部分在樣本離體后,用預冷的PBS清洗雜質,無塵紙吸干后采集樣本;
去除非目標組織及衰老、霉變等干擾部分�
樣品剪切成小塊,錫紙包裹或放入凍存管中;
將組織塊液氮速凍5 min以上,并�-80℃保存�
幼嫩的根、葉、花、愈傷組織等常規植物組織,定量蛋白質組推薦送樣量>1g;修飾蛋白質組推薦送樣量>2 g�
血液篇
血漿樣�
使用EDTA抗凝劑和蛋白酶抑制劑的血常規管采集血液;
輕輕地上下顛倒混� 8-10 次;
立即4℃,1600 g離心 10 min�
用移液器將血漿轉移到離心管中,加入蛋白酶抑制劑,混勻,瞬時離心�
血清樣�
使用真空采血管收集血液;
輕輕地上下顛倒混�5-6 次;
4℃,靜置15-30 min�
4℃,1600 g離心10 min�
用移液器將上層淡黃色血清轉移到離心管中,加入蛋白酶抑制劑,混勻,瞬時離心�
血�/血清樣本,定量蛋白質組推薦送樣量>500 ul�
細胞�
貼壁細胞
細胞培養至覆蓋度70-90%�
去培養基,培養皿�10 ml PBS�3次,培養皿倒扣,將液體控干�
培養皿置于冰上,胰蛋白酶消化后,加入PBS懸浮細胞�
收集�15 ml離心管中�4℃,400 g-1000 g離心5-10 min,去PBS�
1 ml PBS重懸細胞后轉移到新的1.5 ml離心管;
再次用上述條件離心,盡可能將上清去除干凈�
用適量PBS重懸,液氮速凍,并�-80℃保存�
懸浮/貼壁細胞,定量蛋白質組推薦送樣量>1×107個細胞或體積�50ul細胞沉淀�
磷酸化蛋白質組推薦送樣量>5×107個細胞或體積�200ul細胞沉淀�
乙酰化、泛素化蛋白質組�1×108個細胞或體積�500ul細胞沉淀�
<p style="font>微生物篇
離心法或其他方法分離菌和培養基;
收集菌體�15 ml離心管,�10 ml PBS�3次;
�1 ml PBS 重懸菌體,轉移到1.5 ml離心管中離心,用槍頭吸去上清,記錄菌的濕重或體積�
用適量PBS重懸,每�100 ul分裝,液氮速凍,并�-80℃保存�
微生物菌體,定量蛋白質組推薦送樣量濕重>100mg或體積>100ul;修飾蛋白質組推薦送樣量濕重>300mg或體積>300ul�
膠點膠條�
膠點膠條
膠點/膠條或者泳道皆可,推薦考馬斯亮藍染色,要求條帶清晰,無降解�
IP / Co-IP / Pull-down樣本
蛋白洗脫液要求蛋白總量>5ug,蛋白溶液進行SDS-PAGE電泳,下方兩種電泳方式任選其一即可�
蛋白洗脫液,跑分離膠5cm(不含濃縮膠的SDS-PAGE),切下5cm膠條,放�1.5ml離心管中�
蛋白洗脫液,跑SDS-PAGE標準的膠,切下目標條帶即可,放入1.5ml離心管中�
考慮到動物、植物、細胞、微生物、膠點膠條大家關注度較高,今天小編就先為大家介紹到這里,如果你手上有更加棘手的特殊樣本,不知道如何處理,也可以給小編留言!分享完常見樣本的采集和預處理,下期將會給大家整理不同類型樣本蛋白質提取方法,敬請關�www.bodytornado.com�
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